氧化海藻酸钠应用于体外循环管路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (34): 6159-6165.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.015

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氧化海藻酸钠应用于体外循环管路

李金友¹，李彤²，于美丽³，高文卿²，胡晓旻²，陆海滨¹，于广栋¹

¹天津医科大学研究生院，天津市 300170；²天津市第三中心医院，天津市 300170；³天津市人工细胞重点实验室，天津市 300170

出版日期:2013-08-20 发布日期:2013-08-20
通讯作者: 李彤，教授，天津市第三中心医院，天津市 300170 litongtj@163.com
作者简介:李金友，男，1985年生，安徽省阜阳市人，汉族，天津医科大学在读硕士，主要从事心脏外科研究。xuhuanzenren@163.com
基金资助:
天津市科技支撑计划重点项目(11ZCGYSY02000)；天津市科学技术委员会一般项目(09JCYBJC27600)。

Oxidized sodium alginate used in an extracorporeal circulation pipe

Li Jin-you¹, Li Tong², Yu Mei-li³, Gao Wen-qing², Hu Xiao-min², Lu Hai-bin¹, Yu Guang-dong¹

¹Postgraduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300170, China; ²the Third Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300170, China; ³Key Laboratory of Artificial Cells, Tianjin 300170, China

Online:2013-08-20 Published:2013-08-20
Contact: Li Tong, Professor, the Third Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300170, China litongtj@163.com
About author:Li Jin-you, Studying for master’s degree, Postgraduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300170, China xuhuanzenren@163.com
Supported by:
the Scientific and Technological Program of Tianjin, No. 11ZCGYSY02000*; the General Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission, No. 09JCYBJC27600*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前体外循环肝素涂层管路应用较广，但是价格昂贵，限制了其广泛应用。

目的：将多醛基海藻酸钠涂层到医用聚氯乙烯体外循环管路，筛选出最佳涂层条件和所制备管路的稳定性及抗凝性能。

方法：利用高碘酸钠氧化海藻酸钠，制备高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比分别为1∶8、1∶10和1∶12的多醛基氧化海藻酸钠，采用化学结合的方法将不同氧化度海藻酸钠固定到医用聚氯乙烯体外循环管路表面，筛选出最佳氧化度。以硫酸浓度、聚乙烯亚胺浓度、氧化海藻酸钠浓度、氧化海藻酸钠pH值和温度为因素，采用正交实验筛选最佳涂层条件，评价所制备管路氧化海藻酸钠固定的稳定性及抗凝血性能，并与空白对照组和肝素涂层组进行比较和分析。

结果与结论：氧化海藻酸钠最佳氧化度为高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比为1∶10。筛选出的最佳涂层条件为50%浓硫酸、0.05%聚乙烯亚胺、反应溶液pH值为3.5、反应温度为40 ℃和氧化海藻酸钠质量浓度为2 g/L。氧化海藻酸钠涂层管路组脱落率与肝素涂层组有相似的结果，抗凝血性能稍劣于肝素涂层组(P < 0.05)，但显著优于空白对照组。表明氧化海藻酸钠涂层体外循环管路具有良好的抗凝血性能和较好的稳定性。

关键词: 生物材料, 生物材料与药物控释, 体外循环, 海藻酸钠, 聚氯乙烯, 涂层, 抗凝血性能, 稳定性, 氧化度, 血液相容性, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, a heparin-coated extracorporeal circulation pipe is used widely, but the price is expensive and limits its wide application.

OBJECTIVE: To screen the optimal coating condition of oxidated sodium alginate as a coating material to coat the medical polyvinyl chloride pipe and to evaluate the anticoagulant properties and the stability of the coated pipe.

METHODS: Oxidized sodium alginate was prepared with sodium periodate, and the mole ratio of sodium periodate and sodium alginate was 1:8, 1:10 and 1:12, respectively. Oxidized sodium alginate with different degree of oxidation was coated on the surface of medical polyvinyl chloride pipes by chemical methods, then to select the best degree of oxidation. The optimal coating condition was screened through an orthogonal experiment based on concentrations of sulfuric acid, polyethyleneimine and oxidized sodium alginate, and pH value and temperature of oxidized sodium alginate. Additionally, the anticoagulant properties and expulsion rates of the prepared pipes were evaluated in comparison with the blank control group and heparin-coated group.

RESULTS AND CONCLUSION: The optimal oxidation degree for oxidized sodium alginate was 1:10 for the mole ratio of sodium periodate and sodium alginate. The best coating conditions were 50% concentrated sulfuric acid, 0.05% polyethyleneimine, 40 ℃ of reaction temperature, 2 g/L oxidized sodium alginate, and pH value=3.5. The oxidized sodium alginate coating group had a similar trend compared with heparin-coated group in the expulsion rate. The anticoagulant properties of oxidized sodium alginate coating group were little weaker than those of heparin-coated group (P < 0.05), but significantly better than those of the blank control group. The oxidized sodium alginate-coated extracorporeal circulation pipe has a good anticoagulant property and stability.

Key words: biomaterials, biomaterials and drug controlled release, extracorporeal circulation, sodium alginate, polyvinyl chloride, coating, anticoagulant properties, stability, degree of oxidation, blood compatibility, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

李金友，李彤，于美丽，高文卿，胡晓旻，陆海滨，于广栋. 氧化海藻酸钠应用于体外循环管路[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(34): 6159-6165.

Li Jin-you, Li Tong, Yu Mei-li, Gao Wen-qing, Hu Xiao-min, Lu Hai-bin, Yu Guang-dong. Oxidized sodium alginate used in an extracorporeal circulation pipe[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6159-6165.

图/表（结果） 8

2.1 海藻酸钠氧化度标准曲线 根据标准曲线的建立方法，计算得海藻酸钠氧化度标准曲线：y=675.15x- 0.141 7(R²=0.976 1)，见图1。

2.2 海藻酸钠氧化度 由图2可见随着高碘酸钠摩尔比例的增加，氧化度逐渐增加，Gao等^[24]报道的海藻酸钠氧化度较高时具有明显的细胞毒性，而氧化度小于30%的时候具有较低的细胞毒性，故实验采用较低低氧化度的OSA作为反应原料，选取高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比为1∶12，1∶10和1∶8条件下制备的OSA。

2.3 多糖定量标准曲线建立 根据标准曲线建立方法，得多糖定量标准曲线方程：y=12.955x-0.009 5 (R²=0.994 2)，见图3。

2.4 最佳涂层条件筛选

OSA最佳氧化度的筛选：3种不同摩尔比的氧化度和涂层密度见表1所示，SM组分别与SH组和SL组相比，SM组涂层效果优于SH组和SL组(P < 0.05)；故实验采用氧化度为9.65%的OSA作为涂层材料。

最佳涂层条件的筛选：由SPSS 17.0所生成的正交表及按正交实验结果见表2所示，统计分析结果提示3种酸浓度之间以50%酸涂层效果最好(P < 0.05；3种反应溶液pH值之间以pH值3.5效果较好(P < 0.05)；3种聚乙烯亚胺浓度、3种OSA浓度和3种反应温度之间差异均无显著性意义(P > 0.05)。

根据分析结果结合实验条件筛选出最佳涂层条件为50%硫酸、5%聚乙烯亚胺、反应溶液pH值3.5、反应温度为40 ℃和OSA质量浓度为2 g/L。测试管路性能均以最佳条件制备的管路作为测验材料。
2.5 涂层表面红外表征 见图4所示OSA涂层管路组和肝素涂层管路组在3 350 nm处有一个宽而浅的醛基吸收峰，空白对照组则没有这个吸收峰，表明实验OSA涂层物成功固定在聚氯乙烯管路表面。

2.6 涂层表面凝血功能 各组反应后凝血4项的值见表3。

分析结果提示，OSA涂层管路组凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间均显著长于空白对照组(P < 0.05)，短于肝素涂层组(P < 0.05)；OSA涂层管路组凝血酶时间和纤维蛋白原定量时间均显著长于空白对照组(P < 0.05)和肝素涂层组(P < 0.05)，提示OSA涂层组有良好的抗凝血效果。
2.7 OSA涂层物的稳定性 肝素涂层管路组和OSA涂层管路组脱落率见表4所示，通过对比发现，OSA涂层管路组中OSA脱落率与肝素涂层管路组中肝素脱落率都是从开始逐渐增加到第32小时趋于稳定，尽管OSA涂层管路组脱落率稍高于肝素涂层管路组，但96 h内的总体脱落率较低，稳定性好。

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引言

现在体外循环技术越来越成熟，其应用范围也越来越广，而随着体外循环技术的发展，对体外循环管路血液相容性和生物相容性的要求也随之提高。自发现肝素涂层体外循环管具有良好抗凝血性能和生物相容性，并具有减少体外循环肝素化肝素用量、降低输血率和减少并发症等优点以来^[1]，涌现出各种肝素及其相关涂层方法^[2-3]，目前应用较广的是通过终点固定法结合肝素^[4]。终点固定法涂层肝素较好地保持了肝素的空间构象，保持了其良好的抗凝血性能，使肝素涂层管路获得广泛应用，因其价格昂贵等因素，国内较少将其应用于普通体外循环手术，而国外将其应用于普通体外循环手术获得了较传统体外循环手术更好的效果^[5-6]。此外体外膜肺氧合管路套包一般均是应用肝素涂层的管路，减少血液成分的破坏，减轻炎症反应，减少血栓形成，从而能够使得体外膜肺氧合管路能够长时间部分代替心脏和肺脏功能，在国内被应用于心跳呼吸骤停、爆发性心肌炎、急性呼吸功能衰竭等急症的抢救^[7-9]。但由于肝素原料价格昂贵、制作成本较高等缺点，在一定程度上限制了其广泛应用。海藻酸钠具有优越的生物相容性和一定的抗凝性能^[10]，价格低廉、容易获得，被广泛应用于医学材料和生物工程方面。如应用海藻酸钠等材料制作微囊，可以包载药物，调整海藻酸钠等的比例可以达到较高的药物包载率，能够部分克服胃黏膜对药物的黏附作用，因海藻酸钠等材料可在较高pH值条件下溶解，从而使药物得到释放，提高药物在胃内酸浓度较高环境下的稳定性^[11-12]；如若包载示踪剂，可轻松实现对微囊的示踪，示踪剂包括超顺磁铁能够被MRI识别，硫酸钡可被X射线示踪等，可广泛应用于介入栓塞的示踪等^[13]。应用海藻酸钠为材料，采用微囊化人工细胞技术包埋胰岛细胞，可以进行胰岛细胞移植用于治疗糖尿病，为糖尿病的治疗提供了一个新的思路^[14-15]；包埋甲状旁腺细胞用于激素替代治疗等^[16]，此外国内外学者将海藻酸钠用于骨组织工程材料及人工血管等，可以配合其他材料如磷酸钙骨水泥、壳聚糖等制备组织工程支架，不仅能够提供一定的机械性能，其包载的干细胞还可分化为成骨细胞等，促进骨组织缺损处的修复^[17-19]。而将海藻酸钠用为栓塞剂也受到了国内外学者的重视，目前临床常应用于脾动脉栓塞治疗脾功能亢进、局部肺小动脉栓塞治疗大咳血和栓塞子宫肌瘤供血动脉治疗子宫肌瘤等^[20]。实验通过高碘酸钠氧化获得多醛基的氧化海藻酸钠(oxidated sodium alginate, OSA)，参考终点固定法将OSA涂层物固定到体外循环用医用聚氯乙烯管道表面，筛选涂层最佳条件，并对最佳条件下材料表面固定的OSA进行红外表征，初步评价OSA涂层组的抗凝血性能，并与进口成品美敦力肝素涂层管路、空白对照组进行比较；通过与肝素涂层组脱落率的比较，评价OSA固定的稳定性，以期获得具备良好稳定性和一定抗凝性能的新型体外循环涂层管路。

材料方法

设计：材料学体外观察实验。

时间及地点：于2011年7月至2012年10月在天津市第三中心医院合成实验室完成。

材料：

氧化海藻酸钠应用于体外循环管路实验的主要材料：

实验方法：

OSA的制备及氧化度测定：

OSA的制备：参考文献[21]配质量分数为2%的海藻酸钠水溶液，按不同摩尔比(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶10，1∶12)加入高碘酸钠，避光反应24 h后加入乙二醇终止反应，终止液加入NaCl，混匀后倒入无水乙醇中沉淀、析出，自然干燥。干燥后样品再溶后置于 3 500 u孔径透析袋中透析，冷冻干燥后得终产物OSA。

氧化度标准曲线的建立和测定：按参考文献[22]方法制作海藻酸钠氧化度标准曲线。先配制20%碘化钠溶液和10% α-淀粉糊精溶液指示剂，然后将两者等体积混合后得到工作液。将1×10⁵，2×10⁵，4×10⁵，8×10⁵，1×10⁴，2×10⁴，4×10⁴，8×10⁴，1×10³mol/L的高碘酸钠溶液2.5 mL分别与工作液2.5 mL混匀，避光反应 50 min，用紫外分光光度计测定480 nm处吸光度值，并将上述步骤重复5次，取均值计算得到氧化度标准曲线。取OSA反应液2.5 mL迅速加入工作液2.5 mL，避光作用后测480 nm吸光度值，根据氧化度标准曲线计算高碘酸钠消耗量。

式中，N 为高碘酸钠消耗量(mol)，m₀为海藻酸钠样品质量(g)，198为海藻酸钠单元分子量(g/mol)。

OSA涂层物定量实验：参考文献[23]方法，先配制质量分数5%的苯酚溶液，然后配制0.004，0.008，0.012，0.016，0.02，0.024，0.028，0.032，0.036，0.04，0.06，0.08，1.0 g/L的葡糖糖标准品，将不同质量浓度葡糖标准品2 mL分别加入到10 mL容量瓶，再加入1 mL苯酚，迅速加入5 mL浓硫酸，沸水浴15 min，然后取出容量瓶自然冷却，取反应液在480 nm处测吸光度值；将上述过程重复5次，取均值，计算标准曲线方程，制定多糖定量标准曲线。取OSA涂层反应后溶液2 mL加入 1 mL苯酚，再迅速加入5 mL浓硫酸，沸水浴15 min，冷却后测630 nm处吸光度值，通过多糖定量标准曲线方程计算反应前后OSA浓度差值，并计算OSA涂层密度。

OSA涂层最佳条件筛选：

OSA最佳氧化度的筛选：选用高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比为1∶8，1∶10和1∶12制备的不同氧化度的OSA进行涂层，并分别编号为SH、SM和SL组，计算3组涂层密度并筛选涂层效果最佳的氧化度。

最佳涂层条件的筛选：利用正交设计的方法，将酸的浓度、聚乙烯亚胺浓度、OSA溶液浓度、OSA溶液pH值和温度作为5种因素，每种因素3个水平，酸的浓度分别为40%，50%和70%，聚乙烯亚胺浓度分别为0.05%，0.1%，0.5%，OSA溶液质量浓度分别为0.1，0.5和2 g/L，pH值分别为3.5，6和9，温度分别为30，40，50 ℃；通过SPSS17.0生成正交表，按生成的正交表设计实验，并重复3次，计算涂层密度并筛选最佳涂层条件。

聚氯乙烯管路表面OSA的固定：用H₂SO₄?K₂MnO₄溶液对聚氯乙烯管氧化处理，将氧化后的管路放入预配好的聚乙烯亚胺溶液中进行氨基化修饰，使材料表面形成大量氨基；然后将氨基化的聚氯乙烯管路，置于OSA溶液中与OSA表面的醛基结合，制备出OSA涂层的聚氯乙烯管路，此处选择最佳氧化度及最佳条件的OSA。并设置美敦力肝素涂层管路、空白对照(无涂层的聚氯乙烯管路)为对照。

OSA涂层聚氯乙烯管路的红外表征：对OSA涂层管路组、肝素涂层管路组、空白对照组进行红外光谱分析。分别将3组管路用蒸馏水冲洗3遍，之后将不同组样管干燥，分别置于红外分光光度计下，观察3组的吸收峰。

涂层表面血液凝固时间测定：评价指标包括活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间和纤维蛋白原定量。方法为，剪10 cm²的样管(OSA涂层管路组、肝素涂层管路组、空白对照组)，置于24孔板中待用；取健康自愿者血液，在3 500 r/min条件下离心15 min，离心半径为16 cm，得到贫血小板血浆，测定孵育前凝血4项值；将贫血小板血浆750 μL加入3组24孔板中，置于37 ℃水浴箱内孵育1 h，抽取孵育后的血浆，测定反应后凝血4项的值。

稳定性评价：将已经涂层密度的1 m长的OSA涂层管路连接到体外循环机上，流量控制为2.4 L/min，转流96 h，分别在0.5，1，2，4，8，32，96 h取转流液体，用硫酸苯酚法测转流液中OSA浓度，并计算相应时间点OSA脱落率。用同样的方法将肝素涂层管路连接到体外循环机上，同样的条件转流96 h，留取对应时间点的转流液，并用甲苯胺蓝法测其肝素浓度，计算肝素脱落率。

主要观察指标：OSA涂层聚氯乙烯体外循环管路的最佳涂层条件和所制备管路的稳定性及抗凝性能。

统计学分析：定量资料用以x(_)±s表示，应用SPSS 17.0软件包进行统计学分析，用方差分析进行多组间比较，两两比较利用LSD检验，统计学差异检验标准P < 0.05。

讨论

实验应用高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比为1∶10时所制备的低氧化度(9.65%)的OSA作为涂层材料，因梁晔等^[25]报道，当较高氧化度(47%)时，大剂量的OSA对细胞表现出较明显的抑制作用，且随着氧化度的增加，细胞毒性也随着增加；但中等氧化度(24%)和低氧化度的OSA就表现出良好的生物相容性，这也与Gao等^[24]的研究结果类似，因为实验所制备的涂层管路最终应用于临床要与血液有直接接触，对生物相容性要求较高，故实验结果采用氧化度低于24%的OSA，因过度氧化的OSA分子片段较低，对其功能基团发挥作用不理想，故实验采用高碘酸钠和海藻酸钠摩尔比为1∶12、1∶10和 1∶8条件下制备的OSA，对应氧化度分别为8.02%，9.65%和12.65%，不仅保留了海藻酸钠的良好生物相容性和一定的抗凝血性能，而且氧化后的海藻酸钠提供了充足终点固定所需的醛基，红外表征也发现OSA涂层管路组和肝素涂层管路组在3 350 nm处有明显的吸收峰，考虑是海藻酸钠多糖或者肝素多糖氧化后所生产的醛基吸收峰，而空白对照组表面无涂层物，没有醛基吸收峰，故在3 350 nm出并没有相应的吸收峰，从而间接证明OSA成功固定在聚氯乙烯管路表面。抗凝血实验中，尽管最佳条件制备的OSA涂层管路组抗凝血性能与肝素涂层管路组相比，活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间延长时间稍短，但与空白对照组相比明显延长，提示OSA涂层管路组具有一定的抗凝血性能。凝血酶原时间是代表凝血机制中外源性凝血系统的重要指标，反映凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的水平；而活化部分凝血活酶时间是反映内源性凝血系统的重要指标，常用于监测肝素用量，能够反映凝血因子Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ水平；OSA涂层管路组与空白对照组相比凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间均显著延长，具有统计学差异，表明OSA涂层管路组管路能够有效抑制内源性和外源性凝血系统。凝血酶时间和纤维蛋白原定量主要反映凝血系统的血栓形成的起始阶段，当内源性和外源性凝血途径启动后产生的凝血酶将纤维蛋白原水解，其纤维蛋白单体再聚合成纤维蛋白多聚体，形成白血栓。OSA涂层管路组与空白对照组相比凝血酶时间和维蛋白原定量均显著延长，而且OSA涂层管路组与肝素涂层管路组相比，凝血酶时间和维蛋白原定量也是增加的，说明其能够抑制血栓的形成，即使在内源性和外源性凝血途径启动以后也能抑制血栓形成，这与Andersson等^[26]报道相一致，说明海藻酸钠及其硫酸盐能有效抑制抗凝血酶Ⅲ依赖性的凝血机制和不依赖抗凝血酶Ⅲ的凝血机制。Mirow等^[27]通过观察采用肝素涂层体外循环管路行冠状动脉搭桥与传统体外循环下行冠状动脉搭桥相比，采用涂层的冠状动脉搭桥能够有效减少术后出血，降低肝素化肝素用量，而且并不促进血小板功能亢进，减少血栓形成，不增加手术并发症风险。 Ovrum等^[28]对6 000组传统的冠状动脉搭桥和采用肝素涂层技术的体外循环下冠状动脉搭桥病理数据比较分析，发现采用涂层技术组术后有减少输血的可能性，能够早期拔管和撤离呼吸机支持。因为实验的OSA涂层管路也能够有效抑制内源性和外源性凝血途径，并且具有较好抑制血栓形成的作用，那么可以预见如果用OSA涂层管路组管路代替普通体外未涂层管路，那么理论上也能够有效减少血栓形成、降低肝素化的肝素用量。 OSA涂层管路组稳定性实验可以看出尽管OSA脱落率稍高于肝素涂层管路组肝素脱落率，但其脱落的趋势和肝素涂层管路组类似，而且OSA涂层管路组96 h内总体脱落率为3.5%，保持在较低水平，表明OSA在管路表面固定较为牢固，稳定性较高，而常规的需要体外循环支持的心脏外科手术，手术时间一般不超过6 h，故OSA涂层管路组的稳定性完全能够满足需短期体外循环对管路的要求。实验结果提示OSA涂层管路不仅具有良好的血液相容性和脱落率较低等优点，而且原材料低廉，制作成本较低。所制备管路能够满足普通的体外循环手术短时间应用，理论上能够起到良好的抗凝、减少血栓形成等作用，能够减少肝素化的肝素用量，降低并发症的发生，为手术效果和术后恢复带来裨益，而且具有广泛应用于临床的前景。

氧化海藻酸钠应用于体外循环管路

Oxidized sodium alginate used in an extracorporeal circulation pipe

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